Назначение: набор Total Nitric Oxide and Nitrate/Nitrite Parameter Assay Kit предназначен для количественного определения окиси азота (NО) в образцах супернатантов клеточных культур, сыворотки, плазмы крови и мочи биохимическим методом в микропланшетном формате.
Длина волны: 540 нм.
Диапазон измерения: 0.78-200 мкмоль/л.
Аналитическая чувствительность: 0.78-200 мкмоль/л.
Принцип метода: метод определяет концентрацию оксида азота NO и основан на ферментном превращении нитрата в нитрит под действием фермента нитратредуктазы. Реакция регистрирует колориметрически концентрацию нитрита по азокрасителю, образующемуся в реакции Грисса. Реакция Грисса основана на двухстадийной реакции диазотирования, в которой кислый NO2- нитрозирующий агент, реагирующий с сульфаниловой кислотой с образованием иона диазония. Этот ион присоединяется к N-(1-нафтил) этилендиамину с формированием цветного азопроизводного, которое поглощает свет на длине волны 540-570 нм.
Приложения теста: биологическое действие окиси азота (NO) было общепризнано после идетификации ее в качестве эндотелиального релаксирующего фактора (EDRF), ответственного за мощные вазодилатирующие свойства стимулированного эндотелия. С тех пор NO был идентифицирован как плейотропный биологический медиатор, регулирующий различные функции: от нервной деятельности до регуляции иммунной системы. Он является газообразным свободным радикалом с коротким временем полужизни in vivo около нескольких секунд. Следовательно, уровень более стабильных NO-метаболитов, нитритов (NO2-) и нитратов (NO3-) используется для непрямого определения NO в биологических жидкостях. Измененные уровни NO ассоциированы с сепсисом, процессами репродукции, инфекциями, гипертензией, физическими нагрузками, диабетом 2 типа, гипоксией и раком.
NO образуется при окислении аминокислоты L-аргинина с участием NADPH, O2, при участии одной из трёх изоформ ферментов семейства NO-синтазы (NOS) с образованием цитруллина. Члены семейства NOS включают нейрональную (nNOS/NOS1), эндотелиальную (eNOS/NOS3) и индуцибельную (iNOS/NOS2) NO-синтазы. Как это следует из названия, nNOS в большом количестве экспрессируется нейронами центральной и периферической нервных систем, а также встречается в клетках других тканей, включая миоциты скелетной мускулатуры, эпителиальные клетки легких и мастоциты кожи. eNOS значительно экспрессируется эндотелиальными клетками, а также может быть найдена в нейронах, кожных фибробластах, эпидермальных кератиноцитах, в фолликулярных клетках щитовидной железы, гепатоцитах и гладкомышечных клетках. iNOS экспрессируется в различных тканях, включая хондроциты, эпителиальные клетки, гепатоциты, глиальные клетки, и в различных типах клеток иммунной системы. В целом, экспрессия eNOS и nNOS происходит конститутивно и регулируется Ca2+/кальмодулином, тогда как синтез iNOS индуцируется эндотоксином и воспалительными цитокинами, и относительно нечувствителен к действию Ca2+.
Благодаря тому, что NO растворим в липидах, он не запасается, но синтезируется de novo и свободно диффундирует сквозь липидные мембраны. Эффекты NO в клетках-мишенях опосредуются через различные механизмы. К примеру, NO-опосредованнная активация фермента гуанилил-циклазы (GC) катализирует формирование вторичного мессенджера 3’,5’-циклического гуанозин монофосфата (cGMP). cGMP вовлечен в ряд биологических функций, таких как регуляция сокращения гладкой мускулатуры, клеточное выживание, пролиферация, ориентация аксонов, пластичность синапсов, воспаление, ангиогенез и активность циклический нуклеотид-управляемых каналов. NO является также антиопухолевым и антимикробным агентом благодаря механизмам превращения в пероксинитрит (ONOO-), формированию S-нитрозотиолов и удалению аргинина. Другая предполагаемая роль NO – угнетение митохондриального дыхания через ингибирования цитохромоксидазы. NO может также модифицировать активность белка посредством посттрансляционного нитрозилирования через присоединение NO (через тиоловую группу остатков цистеина).
Данный набор Total NO/Nitrite/Nitrate Assay R&D Systems имеет 2 аналитические опции. Измерение эндогенного нитрита – первая опция. Превращение нитрата в нитрит с использованием нитрат-редуктазы и измерение общего нитрита – вторая. Для получения концентрации нитрата необходимо вычесть концентрацию эндогенного нитрита из значения общего нитрита.